紫外激發(fā)光源研究植物GFP發(fā)光

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在收到紫光外或者藍光激發(fā)時，發(fā)射綠色熒光，可在各種異源細胞，如細菌/昆蟲以及植物細胞中表達，在植物研究中，通常需要各種顯微鏡來確定該基因是否表達，偶爾也會因為植物自發(fā)熒光導致假陽性的誤判。

觀察GFP發(fā)光可用上海峰志實驗室藍光手電筒LUYOR-3280RB，紫外線激發(fā)光源LUYOR-3280UV，顯微鏡熒光激發(fā)光源LUYOR-3420照射植物，同時需要佩戴專用的熒光觀察眼鏡,使用遮光片觀察效果更佳。GFP熒光反應用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對于單細胞水平的表達也可識別。

綠色熒光蛋白在紫外線的激發(fā)下發(fā)光

GFP是從水母分離出的一種天然熒光蛋白，分子量約27000。為一個由238個氨基酸殘基組成的單鏈多肽，其熒光發(fā)射峰在509nm，zui大激發(fā)波長為395 nm，并在470 nm處有一肩峰，GFP的化學性質(zhì)相當穩(wěn)定，其變性需在90℃或pH<4．0或pH>12．0的條件下用6mol／L鹽酸胍處理。GFP的熒光發(fā)光有兩個明顯的吸收帶，對應于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B。基態(tài)A對應于395nm的吸收峰，基態(tài)B對應于475nm的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1／6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)A 之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A 快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應該存在一個中間過度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A 轉(zhuǎn)變成I ，I 回遷到基態(tài)I時產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I 轉(zhuǎn)變成B ，由B到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對于GFP的作用機理較為認同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過程中的能量受體，并且是zui終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機制各不相同，不同的突變體發(fā)光機制也有很大差異。

圖一：紅色熒光蛋白在LUYOR-3415RG激發(fā)光源的激發(fā)下發(fā)光

除此之外，上海峰志實驗室燈還可以用做以下用途：

1、 野外、實驗室原位測定GFP(綠色熒光蛋白)。

2、 應用于轉(zhuǎn)基因作物研究。

3、 區(qū)別可遺傳性改良生物體和不可遺傳的改良生物體。

4、 用于基因表達的研究。

5、 用于Rhodamine（紅色熒光染料）、葉綠素、熒光素的研究。

為什么藍光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光？

綠光蛋白GFP吸收的光譜峰值為395nm（紫外），并有一個峰值為470nm的副吸收峰（藍光）；雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于長波能量低，細胞忍受能力強，更適合活體檢測，因此通常多使用藍光波段光源（多為488nm）。GFP發(fā)射光譜zui大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。

圖二：LUYOR-3280UV紫外激發(fā)光源

為什么藍光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光？

熒光蛋白GFP發(fā)光原理

熒光蛋白發(fā)光類型屬于斯托克斯位移型，其基本原理是生色團在較高能量的光子照射下發(fā)生構(gòu)象的改變，從而導致分子能級變化，從高能級的構(gòu)象躍遷向低能級時發(fā)出較低能量的光子。生色團在發(fā)光過程中主要有兩種化學過程。一是質(zhì)子轉(zhuǎn)移，即質(zhì)子化和去質(zhì)子化，二是分子構(gòu)象的改變。生色團主要有三種構(gòu)象：A型、B型以 及中間過渡態(tài)Z 型。在分子構(gòu)象變化的同 時還伴隨著氫鍵的生成和斷裂，以及電荷的傳遞去質(zhì)子化和質(zhì)子化的分子構(gòu)象不同， 對應的分子能級也不同，從而其發(fā)射光譜中有兩個特征峰，代表兩種躍遷過程。質(zhì)子化構(gòu)象生色基團通過Tyr66 的脫質(zhì)子狀和質(zhì)子化狀態(tài)(酚羥基)的轉(zhuǎn)換決定熒光發(fā)射。由于酚的激發(fā)態(tài)酸性遠大于其基態(tài), 故僅脫質(zhì)子態(tài)的結(jié)構(gòu)發(fā)射熒光。這個過程是十分迅速的，因此熒光蛋白發(fā)射的是熒光而不是磷光，需要激發(fā)光源持續(xù)存在才可連續(xù)發(fā)光。但是其極快的激發(fā)響應使得熒光蛋白適合作為高靈敏度生物探針以及生物成像材料。

圖三：LUYOR-3415RG激發(fā)光源照射煙草葉片的GFP發(fā)光

熒光蛋白GFP發(fā)光特性

GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強，特別是在450～490nm藍光波長下更穩(wěn)定。在熒光顯微鏡下，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠比熒光素標記的熒光抗體高，抗光漂白能力強，因此更適用于定量測定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應底物，因此GFP作為一種廣泛應用的活體報告蛋白，其作用是任何其它酶類報告蛋白無法比擬的。但因為GFP不是酶，熒光信號沒有酶學放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類報告蛋白，比如熒光蛋白的應用非常的廣泛，已經(jīng)應用于分子標記，體內(nèi)示蹤，信號轉(zhuǎn)導，藥物篩選等生物科研的各個方面熒光讓我們能夠檢測分子的構(gòu)象變化，也能讓我們追蹤化學反應…. 是科學研究的重要手段之一。

熒光蛋白激發(fā)的日常用途

熒光蛋白+激發(fā)光源在生物基因研究中發(fā)揮著巨大的作用，熒光蛋白在激發(fā)光源的激發(fā)下發(fā)出熒光，使得研究效果更直觀。以下為熒光蛋白的10個日常用途，本文為上海峰志摘錄，僅供參考。關(guān)于激發(fā)光源選擇，請咨詢上海峰志：網(wǎng)頁底部.

（1） Localization：可以放在目的基因的N端，也可以放在目的基因的C端。這樣的構(gòu)建方式可以幫助我們觀察到目的基因是什么時候開始表達以及在哪里表達；

（2） Transcription reporter：將熒光蛋白放在待研究啟動子的后面，可以很好的觀察或者驗證該啟動子在特定細胞中的啟動活性；

（3） FRET(Frster Resonance Energy Transfer):用來研究兩個不同的蛋白或者用一個蛋白的兩個不同結(jié)構(gòu)域之間的相互作用關(guān)系。通常是使用激發(fā)/發(fā)射光譜有重疊的兩個熒光蛋白。目前蛋白-蛋白相互作用研究中zui廣泛應用的FRET對就是青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）。

（4） Split EGFP：FRET的另一種實現(xiàn)方法，同樣被用來研究蛋白與蛋白的相互作用。具體是將EGFP分割成兩部分，分別融合到兩個蛋白，當兩個蛋白靠近時，EGFP的兩部分蛋白開始折疊，成熟到發(fā)光。

（5） Biosensors：用來監(jiān)測細胞內(nèi)小生物分子或其他生理過程，比如AAV載體中的鈣指示劑。

（6） Optogenetics：是研究人員使用一種新的光控方法選擇并打開了某種生物的一類細胞。光遺傳技術(shù)–21世紀神經(jīng)科學領(lǐng)域zui引人注目的革新，其主要原理是首先采用基因操作技術(shù)將光感基因（如ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch或OptoXR等）轉(zhuǎn)入到神經(jīng)系統(tǒng)中特定類型的細胞中進行特殊離子通道或GPCR的表達。光感離子通道在不同波長的光照刺激下會分別對陽離子或者陰離子的通過產(chǎn)生選擇性，從而造成細胞膜兩邊的膜電位發(fā)生變化，達到對細胞選擇性地興奮或者抑制的目的。

（7） Chemogenetics：利用遺傳學原理，以化學小分子為工具解決生物的問題，或通過干擾、調(diào)節(jié)正常生理過程了解蛋白質(zhì)的功能。

（8） In Vivo Imaging：活體成像系統(tǒng)成像原理包括生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標記DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應底物發(fā)生生化反應產(chǎn)生生物體內(nèi)的光信號;而熒光技術(shù)則采用熒光報告基因(GFP、RFP)或熒光染料(包括熒光量子點)等新型納米標記材料進行標記，利用報告基因產(chǎn)生的生物發(fā)光、熒光蛋白質(zhì)或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的生物光源。前者是動物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)。

（9） Cell marking/selection：大家做細胞實驗，通常都喜歡質(zhì)粒帶有熒光標簽比如GFP，有了該熒光標簽可以很方便的判斷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。這種情況通常是熒光蛋白由另外一個不同的啟動子控制或者由與目的基因相同的啟動子控制但是通過IRES連接。

（10） FACS：流式細胞分選技術(shù)，可以方便的分選出帶有熒光蛋白的細胞，分選出的細胞可以進行培養(yǎng)或其它處理，做更深的研究.

上海峰志儀器有限公司現(xiàn)貨供應美國路陽、美國nightsea生產(chǎn)的便攜式熒光蛋白激發(fā)光源、手持式GFP激發(fā)光源、臺式激發(fā)光源、體視顯微鏡熒光適配器等，。.