北柴胡 (Bupleurum chinense DC.) 為傘形科柴胡屬植物,是 《中華人民共和國藥典》 (2010年版) 規(guī)定的藥用柴胡基源植物之一,以根入藥,具有解表退熱、疏肝解郁、升舉陽氣功效。主要藥效成分包括柴胡皂苷、揮發(fā)油、類黃酮和多糖等[1]。1977年Acketmann首先成功的用發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacterium rhizogenes) 侵染高等植物獲得毛狀根[2],人們就開始意識(shí)到毛狀根培養(yǎng)對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)和調(diào)控根部藥材藥效成分合成的廣闊前景。以往研究表明誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根不但具有生長迅速、次生代謝物質(zhì)合成能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),而且生產(chǎn)能力穩(wěn)定、不需外源激素,這些特點(diǎn)都有利于天然藥物的開發(fā)和利用[3, 4, 5]。目前,人參[6]、丹參[7]、桑樹[8]、高山紅景天[9]、新疆雪蓮[10]、長春花[11]、黃芩[12]等多種藥用植物建立了毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)體系,通過不同毛狀根根系篩選、培養(yǎng)條件優(yōu)化等手段以獲得更高產(chǎn)量和藥效成分含量。發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的藥用植物遺傳轉(zhuǎn)化已應(yīng)用于植物次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)[4]。利用Ri質(zhì)粒,通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化,還可將外源基因?qū)胝T導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根中[13, 14, 15, 16]。由此,可以通過轉(zhuǎn)化藥效成分合成與調(diào)控相關(guān)基因,在更廣尺度上建立更有價(jià)值的毛狀根培養(yǎng)體系。這一體系也是研究植物基因功能的有效手段[17, 18, 19, 20]。柴胡屬中高氏柴胡 (B. kaoi) 和三島柴胡 (B. falcatum) 的毛狀根誘導(dǎo)可見報(bào)道[21, 22],但未見毛狀根再生植株的報(bào)道。本研究從菌種種類、外殖體類型、侵染方式、侵染時(shí)間等多種毛狀根誘導(dǎo)條件出發(fā),摸索誘導(dǎo)北柴胡毛狀根zui佳條件。隨后,對(duì)毛狀根再生植株培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選,從而建立了穩(wěn)定的柴胡毛狀根誘導(dǎo)和植株再生體系。為柴胡毛狀根的大規(guī)模培養(yǎng)和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定了基礎(chǔ),也為柴胡次生代謝的基礎(chǔ)理論研究,如藥效成分生物合成關(guān)鍵酶基因、代謝調(diào)控基因的功能分析、性狀的基因改良等奠定了基礎(chǔ)。

材料與方法
菌株和植物材料
發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacterium rhizogenes) 菌株ACCC10060為中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所崔光紅老師饋贈(zèng),菌株ATCC11325、A4和K599為大連工業(yè)大學(xué)張宗申老師饋贈(zèng),菌株R1601為實(shí)驗(yàn)室劉小麗博士后保存。含有外源質(zhì)粒的A4菌株的制備: 首先參考文獻(xiàn)[9]制備A4菌株感受態(tài)細(xì)胞,然后利用熱擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pK7GWIWG2D (II) (帶有綠色熒光蛋白GFP基因,購自比利時(shí)VIB生命科學(xué)研究所) 導(dǎo)入A4感受態(tài)細(xì)胞,于附加利福平和壯觀霉素的YEB[23]培養(yǎng)基上篩選,利用GFP特異引物PCR鑒定,選擇陽性克隆A4 (pK7GWIWG2D (II) )。植物材料為本課題組選育的北柴胡新品種“中柴2號(hào)”。

無菌苗培養(yǎng)
取“中柴2號(hào)”品種種子,自來水浸泡24 h,其間每間隔4 h換一次水,75% 乙醇浸泡15 min,無菌水沖洗3次,10﹪次氯酸鈉浸泡30 min,無菌水沖洗5～7次,無菌濾紙吸干表面水分,接種于無激素MS[23]固體培養(yǎng)基上,置于25 ℃條件下暗培養(yǎng)15天左右,種子開始萌發(fā),轉(zhuǎn)入8 h/16 h光照和黑暗交替條件下培養(yǎng)1個(gè)月得到無菌苗。剪取幼苗根、葉片和葉基部,切成0.5～1 cm的切段,接種于愈傷誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基 (MS + NAA 6 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1) 中,25 ℃暗培養(yǎng),誘導(dǎo)愈傷組織形成。選取結(jié)實(shí)的愈傷組織接種于分化培養(yǎng)基 (MS + KT 0.5 mg·L-1 + 蔗糖30 g·L-1) 中,分化成苗。愈傷組織可不斷繼代培養(yǎng),因此可分批次誘導(dǎo)分化成苗,供后續(xù)毛狀根誘導(dǎo)用。

發(fā)根農(nóng)桿菌活化
從 -80 ℃冰箱取出保存的菌種,劃線接種于含相應(yīng)抗生素的YEB培養(yǎng)基上,28 ℃暗培養(yǎng)2天,挑取單菌落,于YEB液體培養(yǎng)基中 (添加相對(duì)應(yīng)的抗生素) 28 ℃、180 r·min-1振蕩暗培養(yǎng)至OD600為1～1.2,再次按1∶100稀釋菌液后搖培OD600至0.6～0.8,5 000 r·min-1離心10 min,收集菌體,用等體積的B5液體培養(yǎng)基重懸菌體,供侵染用。

毛狀根誘導(dǎo)
剪取北柴胡無菌苗不同部位,包括葉片、葉基部、莖基部和根作為供侵染的外殖體,置于無激素B5培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)1～3天。選取發(fā)根農(nóng)桿菌ACCC10060、ATCC11325、A4、K599和R1601作為本實(shí)驗(yàn)供試菌種。將預(yù)培養(yǎng)的外殖體置于B5[24]培養(yǎng)基懸浮的菌液 [附加200 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)] 中浸染,分別采用物理劃傷處理、共搖培處理、超聲波處理和菌液浸泡的侵染方式,侵染時(shí)間設(shè)為15、20和25 min 3個(gè)梯度。侵染后的外殖體用無菌濾紙吸干表面多余菌液,轉(zhuǎn)入不同共培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上,包括B5 + AS 200 μmol·L-1、MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1、B5和MS + NAA 6 mg·L-1,黑暗中共培養(yǎng)3天,在添加500 mg·L-1頭孢霉素的B5液體培養(yǎng)基中清洗后,用無菌濾紙吸干表面液體,轉(zhuǎn)入不同除菌固體培養(yǎng)基 (B5 + Cef 500 μmol·L-1和MS + NAA 6 mg·L-1 + Cef 500 μmol·L-1) 上,置于25 ℃暗室 中誘導(dǎo)發(fā)根。待發(fā)出的根長至2～3 cm,一部分直接轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基中搖培; 另一部分將其切下轉(zhuǎn)接于B5 + 0.15 mg·L-1 IBA的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周 左右,選擇生長迅速、長2～3 cm的根切下,再轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基,25 ℃、90 r·min-1暗培養(yǎng)。剪取北柴胡正常無菌苗的根,與毛狀根液體培養(yǎng)條件相同,做為對(duì)照。

毛狀根再生植株的獲得
將毛狀根液體培養(yǎng)時(shí),產(chǎn)生的黃化小苗直接轉(zhuǎn)入固體MS基本培養(yǎng)基上,于光下培養(yǎng)即可成苗。另外毛狀根液體搖培時(shí),產(chǎn)生的類愈傷組織,將其置于7種不同分化培養(yǎng)基 (表 1) 中進(jìn)行篩選,誘導(dǎo)成苗。當(dāng)小苗長至3～5 cm,移栽至基質(zhì) (蛭石∶沙土=1∶1),放入溫室,觀察生長情況。

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Table 1 List of media screened for plant regeneration from hairy root
毛狀根的檢測(cè)
根據(jù)文獻(xiàn)[24],合成引物rolC-F: 5'-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3'; rolC-R: 5'-TTAG TTCCATCTGCCCATCC-3',PCR擴(kuò)增發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒上T-DNA所含有的rolC基因,證實(shí)是否獲得毛狀根; 根據(jù)質(zhì)粒pK7GWIWG2D (II) 上GFP基因序列設(shè)計(jì)引物 (GFP-F: 5'-CGACGTAAACGGCCACA AGTTCAGCG-3'; GFP-R: 5'-GCCGTTCTTCTGCTT GTCGGCCATGATAT-3'),PCR擴(kuò)增GFP基因,證實(shí)是否可將外源基因轉(zhuǎn)入毛狀根。引物均由上海生工 生物工程有限公司合成。取除菌完全毛狀根及其再 生植株和北柴胡試管苗及其正常根組織各約0.1 g,用新型植物基因組DNA提取試劑盒 (TINAGEN公司) 提取DNA。PCR反應(yīng)總體積25 μL,包括ddH2O 10 μL,Premix PrimeSTAR Hs 12.5 μL (TaKaRa公司),引物各0.5 μL (10 μmol·L-1),模板DNA 30 ng。PCR反應(yīng)程序: ① 94 ℃預(yù)變性5 min; 98 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,40循環(huán); zui后72 ℃延伸10 min; ② 94 ℃預(yù)變性5 min; 98 ℃ 15 s,66 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,30循環(huán); zui后72 ℃延伸10 min。rolC基因擴(kuò)增采用程序①,GFP基因擴(kuò)增采用程序②。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳,EB 染色,紫外燈下觀察。另外,將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pK7GWIWG2D (II) 的發(fā)根農(nóng)桿菌A4誘導(dǎo)的毛狀根及其再生植株,置于轉(zhuǎn)基因生物觀測(cè)鏡DFP-1 (Nightsea) 和Leica DM4000 B LED顯微鏡觀察。

結(jié)果與分析
1 毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)
發(fā)根農(nóng)桿菌A4、R1601、ATCC11325、ACCC10060均可誘導(dǎo)出毛狀根,其中發(fā)根農(nóng)桿菌A4誘導(dǎo)發(fā)根率顯著高于其他3種,約10% 左右,zui低的是ATCC11325,500個(gè)外殖體中只有一個(gè)發(fā)根。將葉片、葉基部、莖基部和根4種不同外殖體用同種菌液同樣條件誘導(dǎo)毛狀根,結(jié)果顯示葉基部的誘導(dǎo)率zui高,葉片次之。另 外,外殖體的大小也影響誘導(dǎo)成功率,長1～1.5 cm、寬0.5 cm的誘導(dǎo)成功率較高,體積過小的外殖體更容易被菌液或抗生素殺死而不會(huì)誘導(dǎo)出毛狀根。以物理劃傷處理、共搖培處理、超聲波處理、菌液浸泡4種不同的侵染方法在相同誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)北柴胡毛狀根,結(jié)果顯示只有菌液浸泡的方法有效。不同侵染時(shí)間也對(duì)誘導(dǎo)率有一定的影響,設(shè)置15、20、25 min 3種不同的侵染時(shí)間,其中20 min侵染時(shí)效果zui佳; 25 min侵染時(shí),后續(xù)除菌困難,外殖體褐化嚴(yán)重。

外殖體除菌培養(yǎng)10天后出現(xiàn)發(fā)根現(xiàn)象。在B5 + AS 200 μmol·L-1、MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1、B5、MS + NAA 6 mg·L-1 4種共培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)北柴胡毛狀根,結(jié)果顯示共培養(yǎng)時(shí)添加乙酰丁香酮的誘導(dǎo)率較高。另外,在B5 + AS 200 μmol·L-1條件下,葉片基部直接發(fā)根,每個(gè)葉片基部通常發(fā)出一條或幾條根 (圖 1-a、b),經(jīng)rolC基因擴(kuò)增證實(shí),如此發(fā)出的根通常均為毛狀根。MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1條件下,先在葉片表面長出愈傷,而后通過愈傷發(fā)出較多條根 (圖 1-c),rolC基因擴(kuò)增證實(shí),其中有不定根,也有毛狀根。

待外殖體上發(fā)出的根長至3 cm左右,一部分直接移入無激素B5液體培養(yǎng)基培養(yǎng),但生長緩慢,直至培養(yǎng)12周后,毛狀根才大量生長 (如圖 1-f)。因此將另一部分外殖體上發(fā)出的根剪取下來移至B5 + IBA 0.15 mol·L-1培養(yǎng)基上,培養(yǎng)至2周,毛狀根分出許多側(cè)根 (如圖 1-d),然后將其移入無激素B5液體培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)6周后 (如圖 1-e),毛狀根大量生長。有些外殖體發(fā)出的根,尤其是通過愈傷發(fā)出的根,從外殖體上剪下置于無激素培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí),開始褐化,不再繼續(xù)生長,也不能產(chǎn)生側(cè)根,應(yīng)為不定根。

綜合北柴胡誘導(dǎo)毛狀根的zui佳條件為: 發(fā)根農(nóng)桿菌A4侵染北柴胡無菌苗葉基部,使用菌液浸泡方法侵染20 min,置于B5 + AS 200 μmol·L-1或MS + NAA 6 mg·L-1 + AS 200 μmol·L-1上共培養(yǎng)3天,再轉(zhuǎn)入添加除菌劑的同樣培養(yǎng)基上誘導(dǎo)發(fā)根,發(fā)出的根先在有激素培養(yǎng)基上短期培養(yǎng)后,再轉(zhuǎn)入無激素培養(yǎng)液內(nèi)大量搖培。

2 毛狀根的植株再生
誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根在液體搖培階段伴隨脫落現(xiàn)象,有些毛狀根根系脫落類似愈傷的組織小塊,繼續(xù)在液體中培養(yǎng),毛狀根本身會(huì)表現(xiàn)出生長緩慢、且逐漸老化的現(xiàn)象 (圖 2-a、b)。將脫落下的類愈傷組織,置于固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)成苗,共設(shè)置了7種含有不同激素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。結(jié)果7種培養(yǎng)基均可使類愈傷組織再生成苗,其中5號(hào)培養(yǎng)基生成的幼苗生長狀態(tài)zui佳 (圖 2-c)。將生成的再生幼苗轉(zhuǎn)置MS基本培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中,在幼苗的根莖部位還可出現(xiàn)分化芽 (圖 2-d),不定芽仍可繼續(xù)長成完整植株,由此得到大量毛狀根再生植株。另外還有些毛狀根根系直接脫落幼苗,由于液體搖培是處于黑暗中,小葉片黃白色 (圖 2-e、f),將其轉(zhuǎn)入固體MS基本培養(yǎng)基上,置于光下培養(yǎng),白化幼苗繼續(xù)生長,葉片轉(zhuǎn)為綠色。幼苗長到一定大小后,其根上又會(huì)脫落下小幼苗,先是長出小側(cè)根,隨后在側(cè)根與主根接合處側(cè)根基部長出兩片小葉片 (圖 2-g)。將再生植株移栽至基質(zhì) (蛭石-沙土=1∶1) 中,再生植株可正常生長,與正常播種的種子植株沒有明顯差別。另外,將再生植株的根剪下放入無激素液體B5培養(yǎng)基中搖培,仍可大量發(fā)根,表現(xiàn)出典型的毛狀根特性。

3 柴胡毛狀根rolC基因和再生植株GFP基因PCR檢測(cè)及GFP綠色熒光檢測(cè)
取A4 (pK7GWIWG2D (II) ) 誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根及其再生植株提取基因組DNA,分別進(jìn)行rolC基因和GFP基因的PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),獲得預(yù)期條帶,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證為rolC基因序列 (圖 3) 和GFP基因序列 (圖 4)。證實(shí)獲得了毛狀根,而且外源基因也已成功整合到柴胡基因組中。另外,使用轉(zhuǎn)基因生物觀測(cè)鏡觀察到了由葉片上誘導(dǎo)發(fā)出的帶綠色熒光的毛狀根 (圖 5-b)。利用顯微鏡也觀察到了毛狀根再生植株的葉片和根中的綠色熒光 (圖 5-i、k)。

討論
發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根及其植株再生體系已在多種植物中得到研究。但是,不同植物誘導(dǎo)條件和植株再生條件都有很大差別,有些植物的發(fā)根難以誘導(dǎo),對(duì)于每種植物的誘導(dǎo)條件沒有固定模式可循,需要針對(duì)研究的植物嘗試摸索出適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件[3, 4, 5]。北柴胡毛狀根誘導(dǎo)和植株再生體系還未見報(bào)道。與北柴胡同屬的其他種,如臺(tái)灣產(chǎn)高氏柴胡 (B. kaoi) 和韓國三島柴胡 (B. falcatum) 的毛狀根研究有報(bào)道[21, 22],但未見柴胡毛狀根再生植株的報(bào)道。三島柴胡毛狀根誘導(dǎo)采用A4菌株,但具體誘導(dǎo)率等情況未見詳細(xì)報(bào)道。高氏柴胡毛狀根誘導(dǎo)是將葉片 基部于無激素B5培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5天,采用R1601侵染5 min后共培養(yǎng)3天,再進(jìn)行除菌培養(yǎng),獲得毛狀根[21]。本實(shí)驗(yàn)也采用了R1601,但誘導(dǎo)率不及A4。與高氏柴胡研究結(jié)果一致的是葉片基部較其他部位如葉片、莖等更容易發(fā)根。本實(shí)驗(yàn)從菌株種類、外殖體種類、侵染方式、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)培養(yǎng)基種類等誘導(dǎo)條件出發(fā),篩選到了能夠誘導(dǎo)北柴胡毛狀根形成的綜合條件,但誘導(dǎo)率在10% 左右。高氏柴胡毛

狀根誘導(dǎo)研究中對(duì)影響毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)的各種因素進(jìn)行了細(xì)致比較,結(jié)果顯示盡管采用根和莖基部為外殖體時(shí),發(fā)根率可達(dá)80% 以上,但是未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的對(duì)照也可形成近 的發(fā)根,表明如此發(fā)出的根絕大部分可能為不定根,從中鑒定篩選出毛狀根較為困難。所以不建議使用根和莖基部作為柴胡 毛狀根誘導(dǎo)的外殖體。除此之外,高氏柴胡毛狀根誘導(dǎo)率與本研究中北柴胡毛狀根誘導(dǎo)率基本一致,也在10% 左右。相比其他植物毛狀根誘導(dǎo)率,有些可達(dá)60% 左右[7, 21, 22],也有些毛狀根誘導(dǎo)難以成功[25],柴胡毛狀根誘導(dǎo)率是否還可提高有待繼續(xù)從菌株和誘導(dǎo)條件等方面摸索。柴胡毛狀根的規(guī)?；a(chǎn)條件也還需要進(jìn)一步探索研究。另外,實(shí)驗(yàn)中獲得了轉(zhuǎn)化有外源GFP基因的毛狀根再生植株,這一體系將應(yīng)用于柴胡重要基因的功能研究。

孫晶1,2, 徐潔森1,3, 趙立子1,3, 魏建和1,3, 楊洪一2, 隋春1,3通訊作者 cscui@implad.ac.cn   
1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院、北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所, 北京 100193;
2. 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院, 黑龍江 哈爾濱 150040;
3. 中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193