紫外線交聯(lián)和免疫沉淀 (CLIP)
原則
紫外線(UV)交聯(lián)是RNA生物化學(xué)家用來(lái)研究活組織中RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的經(jīng)典體外工具。科學(xué)家們已經(jīng)成功地使用CLIP(RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的交聯(lián)和免疫沉淀)來(lái)鑒定神經(jīng)元特異性RNA結(jié)合蛋白Nova家族的許多靶RNA。隨著CLIP技術(shù)的發(fā)展,科學(xué)家們正在試行將其與其他幾種感興趣的RNA結(jié)合蛋白一起使用,特別是FMRP和Hu家族。
圖1.CLIP的基本原理。暴露于紫外線時(shí),近端蛋白質(zhì)和RNA之間形成共價(jià)鍵。這些鍵只發(fā)生在直接接觸的部位,并保留RNA-蛋白質(zhì)相互作用。
紫外線(UV)暴露后,相鄰蛋白質(zhì)和核酸之間形成共價(jià)鍵?;谶@一特殊原理,CLIP已被開發(fā)為使用UV測(cè)定RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物體內(nèi)交聯(lián)的常用方法。裂解交聯(lián)細(xì)胞后,通過(guò)免疫沉淀(IP)分離靶蛋白。為了對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的特異性引物進(jìn)行測(cè)序,RNA接頭被轉(zhuǎn)移到3'末端,放射性標(biāo)記的磷酸鹽被連接到5'末端。使用凝膠電泳和膜轉(zhuǎn)移從游離RNA中分離RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后進(jìn)行蛋白酶K消化以從復(fù)合物中去除蛋白質(zhì)。此步驟在交聯(lián)位點(diǎn)留下肽,從而鑒定交聯(lián)核苷酸。將RNA接頭連接到5'末端后,通過(guò)RT-PCR合成cDNA。后一個(gè)cDNA核苷酸通過(guò)高通量測(cè)序鑒定。將讀段映射回轉(zhuǎn)錄組可以識(shí)別相互作用位點(diǎn)。
程序
圖2.CLIP測(cè)定的工作流程。
1. 組織的紫外線交聯(lián)
從小鼠身上收獲大腦、脊髓或其他靶組織。將組織放在冰冷的HBSS中,直到收獲完成。設(shè)置一個(gè)500mL的Stericup,取下纖維素過(guò)濾器,然后用200μm尼龍網(wǎng)片制作一個(gè)錐形過(guò)濾器以替換它。所得細(xì)胞懸液約為100mL,用于10個(gè)大腦。接下來(lái),將組織懸液轉(zhuǎn)移到 50mL 管中,并在 4°C 下以 2500g 離心 5 分鐘。 除去上清液并將組織重懸于原始組織體積的約10倍。將懸浮液放入150mm組織培養(yǎng)皿中,并將懸浮液放入紫外交聯(lián)儀照射400mJ / cm2。交聯(lián)時(shí),在組織懸浮液下方使用一盤冰塊以保持懸浮液低溫。
將輻照的懸浮液收集在50mL管中,然后用額外的5mL HBSS洗滌每個(gè)板,也收集這種洗滌。在4°C下以2500rpm再次旋轉(zhuǎn)組織5分鐘。 將組織重懸于原始組織體積的2倍,并將溶液移液到管中。短暫旋轉(zhuǎn)試管并取出上清液。在-80°C下冷凍直至使用。
2. 珠子制備
移液 100μL 蛋白 A Dynabead 珠溶液。將磁珠放入磁性支架中,用 500μL 1X PXL 捕獲和清洗磁珠。再重復(fù)洗滌兩次。將磁珠重懸于 100μL 的 1X PXL 中,并加入適量的抗 RNA 結(jié)合蛋白抗體。在室溫下?lián)u動(dòng)試管30分鐘至45分鐘,使抗體與磁珠結(jié)合。用 1X PXL 清洗珠子三次。
3. 交聯(lián)裂解液檢查
使用 100μL 冰冷的 1X PXL 裂解每 100μL 交聯(lián)細(xì)胞。將裂解物放在冰上10分鐘。向每個(gè)試管中加入 10μL RNasin 和 10μL RQ1 脫氧核糖核酸酶;在 37°C 下孵育 15 分鐘。向溶液中加入 1μL RNase T1 儲(chǔ)備液 (1 U/μL);在37°C孵育10分鐘,以1000rpm振蕩。接下來(lái),在預(yù)冷的微量超速離心機(jī)中以 90K 在 4°C 下旋轉(zhuǎn)裂解物 25 分鐘。
4. 免疫沉淀
對(duì)于免疫沉淀,小心地從沉淀碎片中除去上清液,并將上清液添加到一管制備的珠子中。每 300μL 交聯(lián)組織使用約 100μL 磁珠。在 4°C 下?lián)u動(dòng)珠子/裂解物 1 小時(shí)。 用 1mL 冰冷的 1X PXL 清洗 3 次,用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗兩次。
5. 激酶免疫沉淀的RNA
將磁珠重懸于80μL 1X PNK+中,加入5μL P32 γ-ATP(γ-腺苷三磷酸)(>3000Ci/mM)和2μL PNK酶。在37°C的熱混合器中孵育,并以1000rpm離心20分鐘。通過(guò)加入5μL 1mM ATP完成反應(yīng)。讓反應(yīng)在 37°C 下再繼續(xù) 5 分鐘。 用 1mL 冰冷的 1X PNK+ 清洗珠子四次。將磁珠重懸于30μL 1X PNK+和30μL Novex LDS上樣緩沖液中。
6. SDS-PAGE凝膠和轉(zhuǎn)印
加載 2 孔/管的 Novex NuPAGE 10% 雙三凝膠。在150V下運(yùn)行凝膠,直到染料前沿位于凝膠底部。凝膠電泳后,使用Novex濕轉(zhuǎn)印裝置將凝膠轉(zhuǎn)移到一塊S&S BA-85硝酸纖維素上。轉(zhuǎn)移后,用1X PBS沖洗NC過(guò)濾器,并在餐巾紙上輕輕吸干。用保鮮膜包裹膜并暴露在薄膜下。
7. 切出交聯(lián)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物
一般來(lái)說(shuō),RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物以大約蛋白質(zhì)和RNA的總分子量運(yùn)行。使用手術(shù)刀刀片切掉這條帶子,然后將硝酸纖維素切成小塊。將這些碎片放入一個(gè)干凈的管子中。
8. RNA分離純化
在1X PK緩沖液中制備4mg / mL蛋白酶K溶液;將該儲(chǔ)備液在 37°C 下預(yù)孵育 20 分鐘以消化任何 RNase。向每管分離的NC片中加入200μL該蛋白酶K溶液;在37°C振蕩(1200rpm)孵育20分鐘。加入 200μL PK/7 M 尿素緩沖液;在37°C振蕩(1200rpm)下再孵育20分鐘。
加入 400μL RNA 苯酚和 130μL CHCl3 溶液。渦旋這些管,然后在37°C下以1400rpm振蕩(1200rpm)孵育20分鐘。接下來(lái),在4°C或室溫的微量離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)管10分鐘。將每個(gè)試管的水相放入干凈的試管中,加入 50μL 3M NaOAc、pH 5.2 和 1mL 的 1:1 乙醇和異丙醇混合物。在 ?20°C 下沉淀過(guò)夜。
9. 核糖核酸連接
在冷離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)RNA30分鐘。用 100μL 75% 乙醇洗滌沉淀,然后在 SpeedVac 中干燥沉淀。通過(guò)切倫科夫計(jì)數(shù)在閃爍計(jì)數(shù)器中計(jì)數(shù)RNA。使用 T4 RNA 連接酶進(jìn)行 RNA 連接。
10. 連接RNA的純化
如上所述旋轉(zhuǎn)、洗滌和干燥 RNA 沉淀。通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)器中的Cerenkov計(jì)數(shù)檢查RNA回收率。倒入20%變性聚丙烯酰胺凝膠(1:19雙:丙烯酰胺,7M尿素)。將整個(gè)連接反應(yīng)重懸于5μL H 2 O和5μL甲酰胺上樣緩沖液中。將重懸的RNA在95°C下加熱5分鐘,然后將整個(gè)溶液上樣到凝膠上;使用放射性標(biāo)記的PhiX標(biāo)記物來(lái)調(diào)整RNA的大小。
凝膠電泳后,將凝膠放在一塊舊薄膜上,并用保鮮膜包裹。將薄膜放在-80°C下,通常過(guò)夜以獲得良好的信號(hào)。使用曝光的薄膜,切出大于約65nt的RNA。將凝膠切片放入試管中;加入350μL核酸洗脫緩沖液,用1mL注射器柱塞壓碎;在熱混合器中以 37°C 以 1200rpm 孵育 30 分鐘。用切斷的P1000,將凝膠漿液轉(zhuǎn)移到已添加1cm玻璃預(yù)過(guò)濾器的色譜柱中。在微量離心機(jī)中全速旋轉(zhuǎn)色譜柱,取出流通物并將其放入干凈的管中。加入 1mL 1:1 乙醇和異丙醇混合物以及 2μL 糖原(20mg/mL 原液),并在 ?20°C 下沉淀過(guò)夜。
11. cDNA 和 PCR
如上所述旋轉(zhuǎn)、洗滌和干燥 RNA;在閃爍計(jì)數(shù)器中再次計(jì)數(shù)RNA以定量產(chǎn)量。將純化的RNA重懸于9μL H 2 O中,并以5pmol/μL加入2μL DP3。在65°C加熱5分鐘;放松和快速旋轉(zhuǎn)。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
倒入10%變性聚丙烯酰胺凝膠,并在凝膠上運(yùn)行約10μL的PCR反應(yīng);使用放射性標(biāo)記的標(biāo)記物和放射自顯影凝膠。剪掉大約 60-100nt 的主要波段(如果有的話,還可以切掉 100nt 及以上)。像上面對(duì)RNA所做的那樣純化和沉淀DNA,但讓DNA從粉碎的凝膠漿液中洗脫至少4小時(shí)。沉淀后,將純化的DNA重懸于5–10μL水中。
12. TOPO克隆和測(cè)序
我們又使用了三到四輪PCR(如果您的次PCR產(chǎn)量較低,則可以使用更多)。使用離心柱對(duì)反應(yīng)進(jìn)行脫鹽。然后,生成 3' A 端。在72°C孵育20分鐘;放在冰上,立即用于TOPO克隆反應(yīng)。輕輕混合并在室溫下孵育 5 分鐘(儲(chǔ)存 3μL,在 ?20°C 下進(jìn)行天克隆時(shí)不使用,以進(jìn)行潛在的后續(xù)轉(zhuǎn)化)。按照 TOPO 克隆試劑盒的建議轉(zhuǎn)化大腸桿菌。像其他測(cè)序反應(yīng)一樣對(duì)單個(gè)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行小型制備和測(cè)序。
13. 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索
如果不能識(shí)別CLIP標(biāo)簽的親本RNA,那么CLIP實(shí)驗(yàn)就毫無(wú)用處。美國(guó)生物技術(shù)信息中心 (NCBI) 現(xiàn)在有一個(gè)專門的 BLAST 搜索頁(yè)面,供那些尋找簡(jiǎn)短、幾乎完全匹配的人使用,它非常適合 CLIP 標(biāo)簽識(shí)別。
本文由谷歌翻譯軟件自動(dòng)翻譯,原文請(qǐng)瀏覽www.creativebiomart.net/resource/principle-protocol-crosslinking-and-immunoprecipitation-clip-388.htm