光交聯(lián)技術(shù)的生物應(yīng)用研究進(jìn)展

摘要：光交聯(lián)反應(yīng)作為一種快速、簡單和時(shí)空可控的交聯(lián)工具廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)和材料等不同研究領(lǐng)域。本文詳細(xì)介紹了常用的小分子光交聯(lián)基團(tuán)的結(jié)構(gòu)、分類及反應(yīng)機(jī)理，重點(diǎn)綜述了光交聯(lián)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。目前大多光交聯(lián)基團(tuán)僅對(duì)紫外和可見光具有敏感性，紫外和可見光穿透力弱、組織吸收強(qiáng)和散射等問題嚴(yán)重限制了該技術(shù)在生物體內(nèi)的應(yīng)用研究。因此，進(jìn)一步研究光交聯(lián)技術(shù)在生物體系的應(yīng)用和開發(fā)長波長光（如近紅外或遠(yuǎn)紅外光）介導(dǎo)的新交聯(lián)技術(shù)對(duì)于藥物研發(fā)和疾病診療具有重要的科學(xué)意義。

引 言

光化學(xué)反應(yīng)又稱光化作用，一般是指物質(zhì)在可見光或紫外線照射下，物質(zhì)分子吸收光子后所引發(fā)的化學(xué)反應(yīng)。目前能激活物質(zhì)分子的光源種類繁多，如紅外光、可見光、紫外光、激光等。紫外光一般對(duì)光化學(xué)反應(yīng)為有效；紅外光由于能量低，只能引起分子化學(xué)鍵的振動(dòng)擾動(dòng)，很難引發(fā)化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生；而可見光常常被用作光化學(xué)反應(yīng)的引發(fā)劑，通常是以光敏劑作為媒介，間接地將光能轉(zhuǎn)移到一些可見光不敏感的反應(yīng)中去，進(jìn)而引起光化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生?？傊?，光介導(dǎo)的化學(xué)反應(yīng)具有操作簡單、反應(yīng)速度快、副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化學(xué)的要求，受到光化學(xué)研究者們的廣泛青睞。上海峰志儀器有限公司提供253nm、302nm、365nm、395nm紫外交聯(lián)儀以及450nm、530nm、660nm可見光交聯(lián)儀。

光交聯(lián)是光化學(xué)反應(yīng)中目前應(yīng)用為廣泛的一種反應(yīng)。光交聯(lián)反應(yīng)（也稱作光親和標(biāo)記，photoaffinitylabeling,pal）是指將合成的光敏小分子化合物作為工具探針，在特定波長的光照射下，產(chǎn)生高活性的中間體，與其受體活性部位形成特異性的不可逆共價(jià)鍵結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)。早在1962年，westheimer等人首先提出光親和標(biāo)記技術(shù)，至今該技術(shù)已取得令人矚目的發(fā)展。由于光交聯(lián)反應(yīng)具有速度快、條件簡單、適合于原位反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，早主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾和藥物靶標(biāo)蛋白甄別。之后，光交聯(lián)反應(yīng)逐漸被應(yīng)用于研究蛋白與小分子、生物大分子、蛋白或受體間的相互作用。目前該技術(shù)已經(jīng)成為生物化學(xué)家和分子生物學(xué)家研究生物體系中空間相鄰組分及生物大分子間相互作用的一個(gè)重要工具。近年來，隨著光學(xué)技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，光交聯(lián)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于化學(xué)、生物、材料和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

２ 光交聯(lián)反應(yīng)基團(tuán)及其作用機(jī)制

常見的光交聯(lián)基團(tuán)根據(jù)其在光照射下生成活性中間體的不同，大致分為四類：氮賓（nitrenes）類、卡賓（carbenes）類、碳正離子（carbocations）和自由基（radicals）類（如圖 １）。目前應(yīng)用為廣泛的光交聯(lián)基團(tuán)有苯甲酮、疊氮苯和3三氟甲基3苯基二吖丙啶（３ trifluoromethyl 3 phenyldiaz irine TFMD）。通常理想的光交聯(lián)基團(tuán)應(yīng)具備以下幾個(gè)特征：（１）具有一定的化學(xué)穩(wěn)定性，耐受普通的化學(xué)反應(yīng)；（２）在自然光中具有合理的穩(wěn)定性；（３）黑 暗 中 穩(wěn) 定，在 不 對(duì) 樣 品 造 成 損 傷（＞３００ｎｍ）的紫外光照下很容易光解；（４）光解后的活性中間體既能與親核的 XH（Ｘ＝Ｎ，Ｓ，Ｏ）官能團(tuán)反應(yīng)，也能與 ＣＨ官能團(tuán)反應(yīng)；（５）光解中間體與受體作用得到的產(chǎn)物應(yīng)該比較穩(wěn)定，能夠耐受分離、純化和分析等操作.

２．１ 氮賓（nitrnenes）類

芳香疊氮化合物是常見的產(chǎn)生氮賓（nitrnenes）類前體的化合物，也是較常用的光交聯(lián)基團(tuán)。它的光化學(xué)反應(yīng)機(jī)理為：分子在外來光照射

下，芳環(huán)上的疊氮基團(tuán)會(huì)首先形成單線激發(fā)態(tài)，然后釋放出氮?dú)馍傻e。氮賓可以是單線態(tài)的中間體，也可以經(jīng)系間竄越形成三線態(tài)中間體。單線態(tài)氮賓可以對(duì)CH鍵或者XH鍵（Ｘ ＝Ｏ，Ｎ，Ｓ）進(jìn)行插入反應(yīng)形成共價(jià)鍵結(jié)合的產(chǎn)物，也可以重排為 １氮雜２４６環(huán)庚四烯（didehydrozaepine）或者通過系間竄越形成三線態(tài)中間體。三線態(tài)中間體以自由基形式吸收質(zhì)子氫生成氨基化合物或形成偶聯(lián)產(chǎn)物。因此，單線態(tài)氮賓具有親電子活性，是發(fā)揮交聯(lián)作用的主要形式。但是，單線態(tài)氮賓只能夠穩(wěn)定存在約100us，隨后將迅速重排生成比較穩(wěn)定的烯亞胺，這種烯亞胺分子的反應(yīng)活性較弱，只能與親核性官能團(tuán)反應(yīng)（如 ＯＨ、ＮＨ、ＳＨ等）。如果活性位點(diǎn)部分沒有親核性官能團(tuán)，那就可能遷移到離活性位點(diǎn)較遠(yuǎn)區(qū)域交聯(lián)，產(chǎn)生非特異性交聯(lián)。

２．２ 卡賓（carbenees）類

卡賓類分為重氮化合物和雙吖丙啶類化合物。重氮化合物與疊氮化合物類似，在紫外光的照射下，重氮基團(tuán)釋放一個(gè) Ｎ２分子，形成卡賓中間體，隨后進(jìn)攻鄰近的 Ｃ－Ｈ鍵，生成一個(gè)新的共價(jià)鍵。該卡賓中間體也會(huì)進(jìn)行 Ｗｏｌｆｆ重排，形成烯酮，烯酮再與親核試劑反應(yīng)，產(chǎn)生非特異性交聯(lián)。雙吖丙啶基團(tuán)在黑暗中具有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)具有較好的光交聯(lián)活性。其反應(yīng)機(jī)理：在３５０ｎｍ或 ３６５ｎｍ紫外光的照射下，雙吖丙啶基團(tuán)首先發(fā)生共價(jià)鍵斷裂，釋放出一分子 Ｎ２，隨后鍵電子重排，形成活性的卡賓中間體，插入到鄰近的 Ｃ－Ｈ鍵或者其他雜原子與 Ｈ的共價(jià)鍵中，生成新的共價(jià)鍵。這里形成的卡賓中間體半衰期一般在 ｎｓ級(jí)，交聯(lián)反應(yīng)非常迅速。

２．３ 碳正離子（carbocations）

除了氮賓類和卡賓類基團(tuán)外，碳正離子也是具有高活性的光交聯(lián)基團(tuán)［１６］。芳香重氮鹽化合物就是常用的碳正離子前體。首先，芳香重氮鹽化合物在紫外光照射下，釋放 Ｎ２形成高活性的芳香正離子中間體，隨后插入到鄰近的 ＣＨ鍵或者其他雜原子與 Ｈ的共價(jià)鍵中，形成新的共價(jià)鍵。由于芳香重氮鹽化合物上重氮的吸電子性使其在通常條件下非常不穩(wěn)定，一些研究中通過在芳香環(huán)上引入供電子基團(tuán)來改善化合物的穩(wěn)定性［１７］。

２．４ 自由基（radicals）類

自由基是光交聯(lián)反應(yīng)中另一類非常重要的高活性中間體。苯甲酮類化合物是生成自由基的一類常用的、高效的光交聯(lián)反應(yīng)化合物。在紫外光的照射下，苯甲酮基團(tuán)能夠產(chǎn)生活性三線態(tài)雙自由基，自由基分子不發(fā)生重排反應(yīng)，會(huì)與周圍的CH鍵發(fā)生反應(yīng)。如果其周圍沒有適當(dāng)?shù)腃H鍵存在，雙自由基能夠穩(wěn)定存在１２０μｓ，后回復(fù)到初始狀態(tài)，等待再次被激活［１８］。此外，苯甲酮產(chǎn)生的活性三線態(tài)雙自由基在質(zhì)子性溶劑中穩(wěn)，幾乎不與水反應(yīng)，其標(biāo)記效率較高，對(duì)于光交聯(lián)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)非常有用.

４ 結(jié)束語

光交聯(lián)技術(shù)由于其簡便、快捷、高效和時(shí)空可控等優(yōu)勢(shì)目前被廣泛地應(yīng)用于藥物篩選、靶標(biāo)蛋白甄別和生物大分子間作用等研究。隨著納米材料和技術(shù)的飛速發(fā)展，光交聯(lián)技術(shù)近年來從分子生物學(xué)領(lǐng)域逐漸拓展到了納米材料和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。然而，由于目前光交聯(lián)反應(yīng)源主要以紫外光為主，其穿透力淺，組織損害等問題一定程度上限制了該技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入應(yīng)用。如何克服前述問題，使用近紅外或遠(yuǎn)紅外觸發(fā)交聯(lián)反應(yīng)將是一種新的思路，但由于目前對(duì)近紅外或遠(yuǎn)紅外光敏感的化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)報(bào)道較少，發(fā)掘該類化學(xué)反應(yīng)對(duì)于合成化學(xué)家將是一大挑戰(zhàn)。總之，相信不久的將來光交聯(lián)技術(shù)一定會(huì)在化學(xué)、生物、材料和醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域有著更為廣泛的應(yīng)用前景。

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Advances in biological application of photo-crosslinking technique.pdf

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